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中科院上海生化与细胞所发明安全高效的RNAi新技术
来源: www.qd-zyz.com  发布日期: 2019-10-15

RNAi是siRNA介导的具有互补序列的RNA特异性降解的现象,从而在转录后水平沉默靶基因表达。 RNAi在真核生物的进化中高度保守,并已广泛用于基因功能的研究。它可以作为用于疾病治疗的小核酸药物开发。最近,数十种siRNA药物已进入I期或II期临床试验。在继续使用小分子化合物和蛋白质(抗体)药物之后,它有望成为另一种新型药物,具有很大的应用潜力。

RNAi基因沉默功能的核心组成部分是RISC复合体,其主要由外源提供的siRNA和细胞内Ago家族蛋白的组装形成。在哺乳动物中,外源siRNA主要以两种方式获得:一种是通过化学方法直接合成双链siRNA分子,并转染到细胞质中以结合Ago蛋白并沉默靶基因。然而,化学合成siRNA的成本很高,并且很容易通过细胞或动物的代谢(如核酸酶)去除,并且作用持续时间短,并且某些类型的原代细胞难以有效转染,因此有一定的应用。局限性。

获得siRNA的另一种方法是使用DNA载体来驱动shRNA的转录,使用内源RNA聚合酶III(RNA PolIII)的启动子,例如U6,H1等,并且通过转录产生的发夹shRNA可以是细胞内的。 Dicer蛋白的来源识别并加工成siRNA,然后与Ago蛋白结合。 shRNA表达盒不仅可以通过在质粒载体上直接转染细胞进行瞬时基因沉默,而且可以作为慢病毒载体构建,能够长时间感染大多数类型的宿主细胞和沉默靶基因,高通量广泛用于功能基因筛选;如果shRNA是在腺病毒(ADV)和腺相关病毒(AAV)载体上构建的,则可以实现动物的整个或特定组织中的靶基因的沉默。

随着RNAi技术的广泛应用,其自身的一些缺点逐渐显现,包括:

不中。由于siRNA不仅可以通过完全互补配对切割靶RNA,而且通过与RNA互补配对非特异性地抑制靶基因,类似于miRNA(microRNA)作用模式(即2-7个种子区域的碱基配对)其他表达基因比其他人。

细胞内源性miRNA的竞争性抑制。由于shRNA的加工需要蛋白质因子如细胞中的Dicer,Exportin-5和Ago的帮助,因此这些蛋白质因子也是处理细胞中内源性miRNA所必需的。由于miRNA是细胞功能的重要调节分子,过表达的shRNA与内源miRNA竞争相同的加工机制,这不可避免地抑制内源miRNA的表达和功能。研究表明,目前使用的传统shRNA对内源性miRNA具有很强的非特异性竞争性抑制作用。 shRNA在小鼠肝脏中的长期高表达可导致严重的肝损伤并导致肝癌导致动物死亡。因此,如何设计更好的RNAi载体以减少毒副作用,同时有效地沉默靶基因是RNAi技术应用中需要解决的关键科学问题。

吴立刚博士学生尚仁福等。研究了具有不同茎环结构的siRNA前体的加工和功能,并在此基础上,发明了一种比传统shRNA具有更高效率和更少脱靶效应的新型RNAi。载体 - saiRNA(单链Ago2加工的干扰RNA)。与传统shRNA不同,saiRNA的茎环结构具有较短的双链区,Ago2蛋白在双链区的3'侧直接切割,并在细胞内进一步加工以产生单链siRNA。长度为24-27 nt。通过在saiRNA的3'末端进一步合并HDV核酶,核酶的有效自切割活性在saiRNA的3'末端准确地产生双碱基突出,大大提高了saiRNA前体的结合效率。 Ago2蛋白质。这显着增强了靶基因的沉默效率。与传统shRNA相比,saiRNA具有以下优势:

脱靶很小。哺乳动物中的Ago蛋白家族包含四个成员,但只有Ago2具有RNAi活性(削弱完全互补配对RNA的核酸内切酶活性),而Ago1,3和4没有RNAi活性但会引起强烈的脱靶效应。由传统shRNA产生的siRNA可以与所有Ago蛋白结合。只有在结合Ago2后才能加工saiRNA以产生成熟的siRNA,从而有效地避免了Ago1,3,4介导的脱靶效应。并且其特殊的加工方法仅产生引导链(具有基因沉默功能的siRNA链),并且不产生过客链(siRNA链没有与引导链互补的基因沉默功能),因此它完全避免了产生的脱靶效应。过客链与Ago蛋白结合。

对细胞内源性miRNA的影响很小。无论是通过基于RNA聚合酶III的DNA表达载体在细胞中转录的化学合成的saiRNA还是saiRNA,通过加工产生的siRNA的单位浓度比常规shRNA更有效。因此,在相同的沉默效率下,saiRNA产生的成熟siRNA在细胞中的积累比shRNA少得多,避免了大量Ago蛋白的占据,并且其加工不需要miRNA加工所需的蛋白质因子,如Dicer ,大大减少了对细胞内源性miRNA的加工和功能的竞争。因此,saiRNA是一种具有高效率和低脱靶的新型RNAi载体。它将通过持续优化saiRNA设计和动物基因沉默实验,为科学研究和基因治疗应用提供更安全,更有效的工具。